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‘Learning from Seeds‘: Optimierung der somatischen Embryogenese durch den Vergleich somatischer mit zygotischen Embryonen bei Cyclamen persicum

Entwicklungsstadien der somatischen und zygotischen Embryogenese für metabolomische Analysen (Winkelmann et al. 2015). (A) Samenkapsel 11 WNB, (B) Schnitt durch Samen 11 WNB, (C) Testa (links) and Endosperm (rechts) aus Samen 11 WNB, (D) zygotischer Embryo aus Samen 11 WNB, (E) torpedo förmiger somatischer Embryos 4 Wochen nach Differentiation.

Cyclamen persicum ist eine ökonomisch wichtige und eine der beliebtesten Zierpflanzen. Als Alternative zu der arbeits- und kostenintensiven Vermehrung über Samen können Cyclamen über den In-vitro-Regenerationsweg der somatischen Embryogenese klonal vermehrt werden. Die Nutzung der somatischen Embryogenese für die kommerzielle Massenvermehrung ist aufgrund Embryogenitätsverlusten über mehrere Subkulturen, asynchroner Differenzierungen und Entwicklungsstörungen noch begrenzt.

Für ein grundlegenderes Verständnis dieser Prozesse und einer dadurch ableitbaren Verbesserung des Systems werden in unserer Abteilung derzeit die Unterschiede zwischen den Entwicklungsprogrammen der zygotischen und somatischen Embryonen in einem umfassenden Ansatz untersucht. Cyclamen persicum stellen dabei einen „angewandten Modellorganismus“ für uns dar. Die Basis des Erkenntnisgewinns stellen Ergebnisse aus dem Vergleich der zygotischen mit der somatischen Embryogenese auf transkriptomischer, proteomischer und metabolomischer Ebene dar. Mittels eines in den letzten Jahren entwickelten und effizienten Agrobacterium tumefaciens basierten Transformationsprotokolls können identifizierte Schlüsselgene der somatischen Embryogenese molekulargenetisch charakterisiert werden.

 

 

Kooperationen

  • PD Dr. Hardy Rolletschek, Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung, Gatersleben
  • Dr. Ljudmilla Borisjuk, Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung, Gatersleben
  • Prof. Dr. Karsten Niehaus, Centrum für Biotechnologie – CeBiTec, Universität Bielefeld
  • Prof. Dr. Hans-Peter Braun, Institut für Pflanzengenetik, LUH

 

Optimierung der somatischen Embryogenese bei Cyclamen persicum – Einfluss der Sauerstoffkonzentration, ROS und Zusammenhänge mit programmiertem Zelltod

Hintergrund & Ziele

Bisherige Optimierungsansätze des In-vitro-Regenerationssystems der somatischen Embryogenese hatten vorrangig die Zusammensetzung des Kulturmediums und die Untersuchung von einzelnen biochemisch bzw. physiologisch wirksamen Medienzusätzen zum Inhalt. Erst durch das kürzlich erweiterte Verständnis der Rolle von ROS (reaktiven Sauerstoffspezies, reactive oxygen species, OH, H2O2, O2-) wird über deren Rolle in Entwicklungsprozessen, insbesondere der Embryogenese und Samenentwicklung, nachgedacht. Dabei spielen ROS je nach Konzentration unterschiedliche Rollen: In geringen Konzentrationen werden ihnen Signalfunktionen zugeschrieben, in hohen Konzentrationen wirken sie negativ und können den programmierten Zelltod auslösen. Die aktuelle ROS Konzentration in einem Gewebe hängt dabei von den verfügbaren Quellen für ROS ab und von der Menge und Aktivität von Enzymen, die zur Detoxifizierung der ROS beitragen, sowie nicht-enzymatischen Antioxidantien, wie Glutathion ab. Die Entstehung von ROS in Reaktion auf Stress wurde beschrieben. Interessant ist zudem die enge Verknüpfung der ROS mit Phytohormonen, insbesondere Abscisinsäure (ABA) und Gibberellinen.

Methodik

Zunächst wird die Umgebung zygotischer Embryonen charakterisiert, das heißt das Endosperm wird im Hinblick auf O2 Konzentration, ABA-Konzentration, pH und ROS während der Samenentwicklung untersucht. Zur Lokalisation, wie auch zur Konzentrationsbestimmung von H2O2 während der somatischen und zygotischen Embryogenese, werden Transformationsexperimente von C. persicum mit einer Version des GFP Gens durchgeführt, das H2O2 im Gewebe anzeigt. Die daraus resultierenden Erkenntnisse werden in einem zweiten Schritt dann zur gezielten Beeinflussung und Veränderung einzelner Parameter während der somatischen Embryogenese in vitro appliziert. Diese könnte durch ROS Applikation oder deren Bindung wie auch durch gezielt veränderte Genexpression erreicht werden. In einem proteomischen Ansatz sollen Proteine, die aufgrund von oxidativem Stress während der Differenzierung somatischer Embryonen carbonyliert werden, identifiziert werden.

Programmierter Zelltod (PCD) ist ein wichtiger gesteuerter Prozess, bei dem redundante, beschädigte oder nicht mehr für die Funktion notwendige Zellen eliminiert werden, um multizelluläre Gewebe zu formieren oder zu erhalten. Dieser Prozess spielt auch eine Rolle bei der somatischen Embryogenese, wie beispielsweise bei Picea abies bereits gezeigt wurde. Um diese Zusammenhänge im System der somatischen Embryogenese bei Cyclamen zu charakterisieren, sollen unter anderem verschiedene Nachweisverfahren für PCD etabliert, die cytologischen Vorgänge bei möglichem PCD während der somatischen Embryogenese charakterisiert und Schlüsselgene, die bei PCD involviert sind in ihrer Expression untersucht werden.

 

A: Transgener somatischer Embryo mit zur Lokalisation von H2O2 mittels roGFP. B: Kalluszellen mit Cytoplasmaablösung nach induziertem programmiertem Zelltod nach Hitzeschock bei 45°C.

Finanzierung/Laufzeit

Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), 2007-2011, Christina Rode

 

DAAD Sandwich Programm 2013-2015, Clarissa Caprestano

 

2013-laufend, Haushaltsmittel

Bearbeitet von

Svenja Ratjens, Clarissa Caprestano, Melanie Bartsch, Traud Winkelmann        

 

Rolle und Funktion von Endophyten in In-vitro-Kulturen

Hintergrund & Ziele

Endophyten sind Mikroorganismen (in In-vitro-Kulturen v.a. Bakterien), die in der Pflanze vorkommen und zu keinen Symptomen führen. Kommt es jedoch zu Verschiebungen des Gleichgewichtes zwischen Pflanze und Endophyten, kann es zu enormen Qualitätsminderungen und Wachstumseinbußen kommen. Es konnte bei In-vitro-Kulturen von Prunus avium gezeigt werden, dass gut vermehrbare Genotypen andere Endophytenzusammensetzungen aufweisen als schlecht vermehrbare Genotypen. Aus den gut vermehrbaren konnten zwei vielversprechende Bakterienisolate gewonnen werden, die als pflanzenwachstumsfördernd eingestuft wurden (Rhodopseudomonas sp., Microbacterium sp.). Diese positive Wirkung konnte mit ersten Inokulationsversuchen nachgewiesen werden und führte zu einer höheren Bewurzelungsrate in vitro (Quambusch et al. 2014).

Das Zusammenspiel zwischen Pflanze und Endophyten sowie zwischen den verschiedenen Endophyten, die in einer Pflanze vorkommen, basiert auf komplexen Interaktionen, die jedoch noch kaum untersucht und verstanden sind. Im Bereich der In-vitro-Kultur stellten Endophyten bislang ein Problem dar und die Strategie war, Endophyten zu eliminieren oder zu unterdrücken. In unserer Arbeitsgruppe wird an einem neuen innovativen Blick auf das Wechselspiel zwischen Pflanze und Endophyten gearbeitet, bei dem der Fokus auf der Balance zwischen positiv und negativ wirkenden Endophyten liegt, um diese nutzbar und steuerbar machen zu können und damit zu einer effizienteren Produktion hochwertiger Pflanzen zu kommen.

Methodik

In einem ersten Projekt konnten mittels kulturabhängiger und kulturunabhängiger Methoden die Endophytenpopulationen von gut und schlecht vermehrbaren Prunus avium Genotypen isoliert und sequenziert werden. Für die beiden Endophyten mit wachstumsfördernder Wirkung wurden qPCR Nachweisverfahren entwickelt. Das Vorhandensein dieser Arten wird im Vergleich zwischen Organen, Im Verlauf der In-vitro-Vermehrung sowie die Analyse eines erweiterten Genotypensets charakterisiert.

A: Endophytische Bakterien der Gattung Microbakterium wachsen aus Blättern einer Prunus avium In-vitro-Kultur, B: Vogelkirschen bewurzelt auf Kulturmedium nach der Inokulation mit dem endophytischen Bakterienisolat N-I-2 (Rhodopseudomonas spp.), C: Stammbaum der aus P. avium erhaltenen Bakterienisolate anhand 16S rDNA (Quambusch et al. 2014).

Förderung, Laufzeit

Ein erstes Projekt ZIM Projekt KF 2508004AJ0 wurde von 2011-2014 in Kooperation mit dem Institut für Pflanzenproduktion in Schnega durchgeführt. Derzeit ist ein Folgeprojekt in der Beantragung.

 

Bearbeitet von

Mona Quambusch, Jane Brümmer, Traud Winkelmann, Melanie Bartsch